Tablety, kapsle, pastilky, čípky a zásypy jsou pevné farmaceutické produkty, které tvoří asi 80-90% trhu s léčivy. Z toho plyne rostoucí význam kontroly procesu krystalizace a fázové čistoty ve farmaceutickém průmyslu. Vedle ekonomických motivů je distribuce a výroba aktivních farmaceutických ingrediencí (API) v požadované krystalové modifikaci také striktním požadavkem všech významných autorit na trhu s léčivy (FDA, SÚKL). V mnoha případech API neposkytují vhodné krystaly potřebné k získání úplných strukturních dat pomocí rtg difrakce. V současné době se proto stále více využívá Nukleární Magnetická Rezonance pevného stavu, která je vhodná nejen pro detekci krystalových forem API, ale také pro detekci forem amorfních

NMR spektroskopie je analytická metoda, která na základě absorpce radiofrekvenčního záření vzorkem umístěným v silném magnetickém poli poskytuje informace o struktuře zkoumané látky. Krátce po svém objevu byla NMR spektroskopie výhradně doménou fyziků, avšak její využití bylo poměrně omezené. S pochopením chemického posunu se však její vliv rychle přenesl do oblasti chemie, kde se významně uplatnila a stále uplatňuje jako analytická metoda. S rozvojem přístrojového vybavení pak přednosti této techniky využila strukturní biologie při popisu komplikovaných proteinů nukleových kyselin a jejich komplexů. Dnes lze významné aplikace nalézt i v průmyslu především ve farmacii a to jak při analýze metabolitů, tak při formulaci vlastního léčiva. V současné době však NMR spektroskopie zasahuje do našeho života snad nejvíce v lékařství a to jako velmi výkonná diagnostická metoda

Historie NMR spektroskopie je velmi bohatá. Za rozvoj a objevy v oblasti NMR bylo uděleno několik Nobelových cen. V roce 1943 získal Nobelovu cenu za fyziku Otto Stern - za objev magnetickeho momentu protonu. V roce 1944 pak Isac Rabi za rezonanční metodu pro zjištění magnetických vlastností atomových jader. První NMR signály vody a parafinu byly naměřeny Felixem Blochem v roce 1946. Později tak kolem roku 1949 se kvalita spekter zlepšila a byla naměřena i první spektra tuhých látek a v roce 1951 pak bylo publikováno jedno z prvních vysoce rozlišených NMR spekter ethanolu. To již byla odhalena podstata chemického posunu. Felix Bloch spolu s Edwardem M. Purcelem v roce 1952 získali za své práce Nobelovu cenu. Již od prvních experimentů bylo jasné, že odezva tuhé látky je zcela jiná než odezva roztoků a kapalin. Tuhé látky produkují velmi široké signály, které téměř nelze interpretovat. První ¹³C spektra byla naměřena v roce 1957. Poslední Nobelova cena, která souvisí s rozvojem NMR technik, byla udělena v roce 2013 Martinu Karplusovi.

Jak je patrné z názvu metody, NMR spektroskopie se zabývá chováním atomového jádra v magnetickém poli. Jedná se o absorpční (emisní) spektroskopii, při které detekujeme absorpci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule. Aktivní jsou pak pouze jádra se spinovým kvantovým číslem I≠0. Tato jádra jsou schopna absorbovat RF záření.

Jádra měřitelná pomocí NMR spektroskopie jsou patrná z tabulky. Spinové stavy jader jsou kvantovány. Důležitou vlastností částic je tzv.magnetický moment, který je závislý nejen na spinovém kvantovém čísle, ale i na gyromagnetickém poměru jádra a Planckově konstantě.

Jak je manipulováno se vzorky, je zřejmé z tohoto obrázku. Vzorek je umístěn do ZrO2 kyvety, jejíž velikost si vybereme dle typu vzorku a měření. Poté kyvetu (rotor) vhodíme do magnetu a začneme kyvetou rotovat. Jak již bylo zmíněno, tak od prvních experimentů bylo zřejmé, že odezva tuhé látky je zcela jiná než odezva roztoků a kapalin. Primární příčinou rozšíření spektrálních čar v tuhém stavu je chybějící izotropní molekulární pohyb. Toho v roce 1958 a 1959 využili Andrew a Law, kteří si uvědomili, že chybějící molekulární pohyb lze nahradit pohybem rotačním. Pokud osa rotace svírá úhel 54,7 se směrem magnetického pole a pokud je frekvence rotace dostatečná dojde v časovém okně NMR experimentu k jakési efektivní symetrizaci. Rychlá rotace vnutí jadernému systému kubickou symetrii. Tímto způsobem lze opětovně dosáhnout zúžení NMR signálů. Rotace vzorku pod magickým úhlem (Magic Angle Spinning) je tak jednou ze základních technik moderní NMR pevného stavu. Trvalo téměř 20 let než dosáhla širokého uplatnění.

Poté je třeba ještě naladit frekvenci měřeného jádra (tzv. wobováním) – stejně jako když ladíme rádio a na pracovní stanici můžeme začít s měřením.

A teď trochu detailněji: Co se děje se vzorkem? V základním stavu (bez působení magnetického pole) jsou spiny (celkové magnetické momenty jader) uspořádány náhodně a mají stejnou energii (1). Pokud na spiny začneme působit vnějším magnetickým polem, rozdělí se na dvě hladiny (2). Jedna bude mít nižší energii oproti základnímu stavu, druhá naopak vyšší. Na hladině s nižší energií bude mírný nadbytek spinů, oproti druhé hladině. Čím bude vnější magnetické pole silnější, tím bude i větší rozštěpení hladin a také větší rozdíl v populaci jednotlivých hladin. Pokud takto rozštěpený spinový systém začneme ozařovat radiofrekvenčním zářením (3), může dojít k absorpci a excitaci jednotlivých spinů na vyšší hladinu. Po ukončení ozařování dochází k deexcitaci (4), kterou následně měříme (5). Odezvu vzorku (FID) – volně doznívající indukce je pak pomocí Fourierovy transformace zpracována na NMR spektrum, které nám je schopno dát potřebnou informaci o struktuře molekul.

Malá a zajímavá historická odbočka se týká právě zpracování FIDu (Free Induction Decay) pomocí FT. R.R Ernst si uvědomil, že z volně doznívající indukce, což je v podstatě kakofonie mnoha frekvencí, lze získat frekvenční spektrum aplikací Fourierovy transformace, která byla vypracována již roku 1822 Fourierem. Fourier byl učitelem matematiky a důstojník armády císaře Napoleona. Za francouzské revoluce byl dokonce odsouzen k smrti. Tato transformace převádí funkce z časové oblasti do oblasti frekvenční. Toho tedy o 150 let později využil R. Ernst k rekonstrukci frekvenčního spektra, za což dostal Nobelovu cenu.

Řada aktivních farmaceutických substancí vykazuje značný polymorfismus, což je schopnost molekuly existovat v několika různých krystalových formách. Již mnohokrát se ukázalo, že různé krystalové modifikace se mohou významně lišit svými farmakokinetickými vlastnostmi a tedy v konečném důsledku i terapeutickými účinky.

Typickým příkladem tohoto „polymorfního“ chování je případ RITONAVIRu, což je léčivo s antivirálními účinky používané při napadení organismu virem HIV. Firma Abbott Laboratories tento lék uvedla na trh v roce 1996, avšak až po 18 měsících bylo zjištěno, že v lékových formách vzniká nový termodynamicky stabilnější polymorf. Rozpustnost této nové formy byla v porovnání s originální modifikací pouze poloviční, a proto u pacientů nedošlo při předepsaném dávkování k dosažení terapeutické koncentrace léčiva v krevním oběhu. Pacienti tedy nebyli touto záměnou krystalových forem přímo poškozeni, ale také nebyli léčeni. A proto se problému polymorfismu věnuje náležitá pozornost a jsou vynakládány nemalé prostředky na to, aby při pochopení všech termodynamických a kinetických faktorů bylo možno bezpečně připravit a identifikovat požadovanou krystalovou modifikaci.

Strukturní určení krystalových forem v jednotlivých lékových formách je však komplikováno pomocnými látkami, kterých může být v systému obsaženo až 95%. Rtg prášková analýza je pak pro určování fázové čistoty API nekomfortní a nepřesná. V případě amorfních forem API je naprosto nevhodná. NMR spektroskopie pevného stavu však poskytuje velmi účinný nástroj. V NMR spektrech jsou jasně zřejmé signály, které určují fázovou čistotu API v lékové formě.

V této práci byl připraven nový typ pevné disperze Simvastatin + pHPMA. Pomocí NMR spektroskopie pevného stavu bylo prokázáno, že Simvastatin v této dispezi tvoří nanoklastry o velikosti 2-3 nm, které jsou dispergovány v tuhé skelné matrici pHPMA. Zároveň bylo zjištěno, že segmentový pohyb Simvastatinu se zvýšil, zatímco segmentový pohyb matrice zůstal nezměněn. Díky podstatně snížené kinetice sorpce vody může zvolený polymer účinněji chránit Simvastatin nebo jiné citlivé léky proti chemickému rozkladu, který může být způsoben dlouhodobým vystavením zbytkové vodě přítomné v polymerní matrice. Navíc díky silným vnitřním vodíkovým vazbám vytváří pHPMA vysoce tuhé polymerní řetězce, které brání translační difuzi molekul simvastatinu a následně jejich krystalizaci. Takto připravená disperze může být považována za nano-heterogenní sklovitý roztok. V této práci bylo prokázáno, že systémy, které využívají pHPMA jako matrici jsou vhodnější než např. PVP.

V této práci byly připraveny bukální filmy (pevné disperze), kde aktivní látkou byl ciclopirox olamin, dále byl součástí glycerol a PEO. Kombinací různých typů experimentů NMR v pevném stavu bylo zjištěno, že byly připraveny dva různé typy bukálních filmů: 1) dvoufázová nanoheterogenní suspenze nebo chcete-li pevný roztok (nízký obsah ciclopiroxu olaminu) a (ii) pseudokokrystalická pevná disperze (vysoký obsah ciclopiroxu olaminu). Tyto strukturní rysy jsou úzce spjaty nejen s mechanickými a fyzikálně-chemickými vlastnosti připravených filmů, ale také s disolučními profily léčiva.

V tomto příspěvku jsme ukázali 3D architekturu pevných disperzí s kyselinou připravených lyofilizací. Byly připraveny a charakterizovány čtyři odlišné typy pevných disperzí s kyselinou acetysalicylovou. Krystalická pevná disperze, amorfní skelná suspenze a dva typy pevných roztoků. Naše experimentální zjištění potvrzují, že strukturní vlastnosti těchto systémů jsou určeny kombinací dvou faktorů: (i) Přístupností a afinitou vhodných molekulárních míst pro utváření interakcí vodíkových vazeb mezi API a polymerní matricí a (ii) segmentovou dynamikou a Tg dané polymerní matrice. Z metodologického hlediska jsme popsali poměrně rychlý a spolehlivý postup umožňující primární strukturní charakterizaci pevných disperzí, který zahrnuje kombinaci DSC, WAXS, 13C CP/MAS NMR spektroskopii a měření 13C-detekovaných T1 (1H) relaxačních časů. Tímto způsobem dokážeme rozlišit různé typy pevných disperzí a prozkoumat homogenitu systémů v měřítku cca. 10-500 nm. Pro získání podrobnější struktury, kdy je třeba prozkoumat rozsah intermolekulárních interakcí, přesně určit velikost molekulárních klastrů a posoudit pevnost H-vazby, je třeba využít pokročilé ss-NMR techniky.

V tomto bodě našeho výzkumu jsme se primárně soustředili na interpretaci a využití jednoduše detekovatelných spektroskopických dat při studiu polymorfismu, především 19F MAS NMR spekter. Ukázalo se totiž, že téměř 30% farmaceuticky aktivních látek obsahuje ve své molekule atom či atomy fluoru. Na druhou stranu atom fluoru se prakticky nikdy nevyskytuje v molekulách přídavných pomocných látek a excipientů.

Liquisolid systémy (LSS) jsou práškové materiály, kde je rozpuštěná API inkorporována na povrchu mezoporézní siliky. Rozpouštědlem API může být např. PEO. Obecně mohou vznikat tři typy LSS: i) LSS, kde je API dokonale rozpuštěná a tvoří kapalný film na mezoporézní matrici; ii) LSS, kde je API částečně rozpuštěná a tvoří kapalný film na mezoporézní matrici + API v krystalické formě a iii) LSS, kde je API částečně rozpuštěná a tvoří kapalný film na mezoporézní matrici + API v amorfní formě. V této práci jsme představili účinnou experimentální strategii pro rychlou strukturní identifikaci těchto systémů. Tento postup je založen na kombinaci tří základních ssNMR technik 1H MAS, 13C MAS a 13C CP / MAS NMR. Kombinace těchto tří technik poskytuje dobrý nástroj pro identifikaci těchto složitých struktur.

V některých případech, však pozorované spektroskopické chování vykazovalo komplikovanější struktury: úzké signály v 1H a 13C MAS NMR spektrech naznačují izotropní kapalné filmy, zatímco úzké signály ve 13C CP / MAS NMR odrážejí chování krystalické fáze.

Pro pochopení tohoto chování bylo nutné zkoumat molekulární dynamiku systému. Dipolární štěpení detekované pro všechny segmenty obou molekul bylo mezi 2 a 4 kHz, což naznačuje geometricky omezené pohyby s vysokou amplitudou. Toto chování bylo již dříve popsáno u kapalně-krystalických fází. Další analýzy ukázaly malé rozdíly v molekulárních pohybech mezi molekulami API a rozpouštědla. ¹H-¹H korelační spektra ukázala „samouspořádávání“ systému.

Všechna tato zjištění naznačují, že molekuly léčiva tvoří relativně kompaktní agregáty, které jsou obklopeny pružnými řetězci rozpouštědla – organogel.

Algináty se řadí mezi hydrokoloidy a jsou rozpustné ve vodě. Tyto biopolymery se získávají z hnědých mořských řas. Na konci 19. století byly intenzivně zkoumány britský chemikem E. C. Stanfordem. V 50-tých letech 20.stol. se začaly vyrábět komerčně. Od té doby bylo objeveno mnoho o všestrannosti tohoto materiálu.

Alginát je po chemické stránce polysacharid tvořený dvěma složkami - manurátem (M) a guluronátem (G). Obě složky jsou do struktury alginátu zabudovány ve formě bloků. V molekule alginátu můžeme střídavě nalézt různě velké oblasti tvořené buď molekulami M, nebo G. Tato zdánlivá maličkost je pro vlastnosti velice důležitá.

Alginátové částice byly připraveny externí iontovou gelací s různými síťovacími ionty.

Interpretací ²³Na MAS NMR spekter byla potvrzena téměř kompletní výměnu Na⁺ iontů. ²³Na 3Q/MAS NMR spektra naznačují koexistenci několika struktur a odlišné lokální geometrie v blízkosti zbytkových iontů sodíku v zesíťovaných alginátech na rozdíl od kontinuální distribuce iontů sodíku v referenčním systému ALG_Na. ¹H NMR spektra jasně odhalují dvoufázový charakter alginátových systémů: (i) úzký signál ve spektru (3-5 kHz) odráží pohyblivé frakce alginátového gelu, které sestávají zejména z molekul vody, a (ii) široký signál (25kHz) odráží rigidní segmenty alginátu.

13C CP/MAS NMR spektra potvrdila klíčovou úlohu M jednotek a M-bohatých bloků při vytváření alginátových gelů. Tato spektra rovněž odhalila silnou závislost mikrostruktury řetězců alginátových polymerů na typu použitých síťujících polyvalentních iontů. Bylo zjištěno, že pravidelnost uspořádání segmentů polymeru systematicky klesá s klesající velikostí (poloměrem) síťujících iontů.

V souladu s 2D ¹H-¹H DUMBO korelačními spektry vykazovaly alginátové gely zesíťované relativně velkým kationtem alkalických zemin (Ba²⁺, Sr²⁺ nebo Ca²⁺) velmi pravidelnou strukturu, zatímco gely zesítěné dvojmocnými ionty přechodných kovů (Zn²⁺) a kationty trojmocných kovů (Al³⁺) vykazovaly větší neuspořádání polymerního řetězce. Je zajímavé, že tato porucha byla téměř výlučně detekována v reziduích M, neboť G jednotky se zdají být vždy strukturálně dobře definované. Všechna naše zjištění tak potvrzují, že bloky bohaté na M jako mediátory, podporují samo-uspořádávání alginátových řetězců. Velké divalentní kationty alkalických zemin slouží jako „plnidla“ a zaujímají většinu volného objemu polymerního gelu. Kombinací 2D ²⁷Al 3Q/MAS NMR spektroskopie s DFT výpočty NMR parametrů jsme jasně identifikovali dvě odlišná šesti-koordinované Al³⁺ síťovací centra s oktaedrickou geometrií lišící se v lokální dynamice. Celkově ssNMR spektroskopie zesíťovaných alginátových systémů poskytla podrobný pohled na jejich strukturu a dynamiku